En LaboMoraga, actualmente utilizamos una prueba de «PCR» para averiguar si alguien está infectado con el nuevo coronavirus, SARS-CoV-2, que causa la enfermedad llamada Covid-19.
La prueba de PCR es tan precisa que puede diferenciar los siete coronavirus que se sabe que causan enfermedades en los seres humanos.
La prueba de PCR busca el material genético del virus en una muestra de hisopo tomada de la nariz o la garganta de una persona. Implica hacer muchas copias de una parte del material genético del virus para que podamos ver si está allí o no.
1) Toma un hisopo ¿Qué está pasando con esos largos palos en la nariz de la gente?
Para saber si una persona tiene coronavirus, un trabajador de la salud usa un hisopo con un eje largo para raspar suavemente la parte posterior de la nasofaringe de esa persona. La nasofaringe es la parte superior de la garganta, justo detrás de la nariz. ¡No muy cómodo!
Después de raspar la nasofaringe, el extremo del hisopo tendrá algunas de las células y el moco de la persona, así como cualquier bacteria o virus que se haya quedado allí. El hisopo se coloca rápidamente en un tubo que contiene una mezcla de proteínas y antibióticos que mantiene a salvo cualquier virus recolectado, luego el tubo se sella y se envía a un laboratorio de pruebas. Puedes ver cómo se toma un hisopo en este video realizado por la empresa de educación médica AMBOSS. Aquí es donde está su nasofaringe:
Problemas con el frotis.
Por lo general, si alguien está infectado con el virus y muestra síntomas, el hisopo debería poder recoger partículas de virus de la nasofaringe. Sin embargo, a veces el virus puede estar multiplicándose en lugares alejados de donde está el hisopo, o todavía no hay suficiente virus alrededor para que el hisopo lo recoja. Por lo tanto, una prueba negativa podría significar que no tiene coronavirus, o que tiene coronavirus y simplemente no es detectable todavía, o se limpió la parte incorrecta.
2) ¿Cómo llega el PCR al LaboMoraga?
Nosotros ofrecemos 3 métodos:
Atención PCR: Puede asistir directamente en nuestras oficinas en Condell 1217 of 210, Valparaíso.
Atención a domicilio: Puedes hacer tu solicitud en este link
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3) Saque el material genético de ARN y límpielo
A qué nos enfrentamos: El coronavirus se compone de dos partes principales: una membrana aceitosa alrededor del exterior, salpicada de proteínas que sobresalen de la superficie, y material genético llamado ARN en el interior, con más proteínas envueltas firmemente alrededor.
Para hacer la prueba para detectar coronavirus, tenemos que romper las partículas del virus para sacar el material genético. También necesitamos deshacernos de todo lo demás en la muestra que podría hacer que la prueba deje de funcionar.
La muestra del hisopo tendrá muchas cosas, incluidos moco y células humanas, así como virus. Las células humanas también están formadas por proteínas, membrana, ADN y ARN.
Eso significa que tendremos que deshacernos de las partes del virus que no necesitamos para la prueba (proteínas y membrana aceitosa) y todo lo demás en la muestra: las proteínas, las membranas aceitosas y el ADN del moco y las células humanas.
Entonces… rompemos las moléculas que no queremos…
Abrimos las partículas del virus usando algunos químicos: un detergente y algo llamado sal caotrópica.
El detergente ayuda a romper las membranas de las células y los virus, que están formados por moléculas aceitosas. La sal caotrópica tiene varias funciones: Desnaturaliza, o desenreda, las diferentes proteínas de la muestra, impidiendo que funcionen y ayuda a separar el ARN de cualquier proteína envuelta a su alrededor. Cortamos las proteínas de la muestra en pedazos usando una enzima llamada proteasa, y cortamos el ADN de la muestra en pedazos usando una enzima llamada DNasa.
… Entonces nos deshacemos de todo excepto del ARN.
Ahora tenemos un tubo con muchos tipos diferentes de moléculas rotas, mezcladas con ARN. Necesitamos deshacernos de todo excepto del ARN.
Para asegurarnos de mantener el ARN y no lavarlo accidentalmente, agregamos pequeñas perlas magnéticas de sílice (vidrio). El ARN se adhiere a las perlas de sílice, ayudado por las sales caotrópicas. Luego colocamos un imán en el exterior del tubo. Las perlas (y por lo tanto el ARN) se adhieren a la pared interna del tubo, sostenidas allí por el imán en el exterior.
Con el imán que sostiene las perlas y el ARN en su lugar, puede lavar fácilmente todos los restos de moléculas no deseadas sin perder el ARN. Agregar líquido con un poco más de sal caotrópica ayudará a hacer esto, luego podemos lavar la sal con un poco de alcohol.
Una vez que el ARN está limpio, podemos despegarlo de las perlas de sílice magnética simplemente lavando las perlas con agua. Cuando el ARN está en el agua, y ya no en las perlas, podemos deshacernos de las perlas usando el imán nuevamente.
4) Asegúrese de que la PCR solo detecte el nuevo coronavirus
El ARN que quede en su muestra será una mezcla de ARN humano y ARN de cualquier bacteria o virus en la nasofaringe de la persona a la que le tomaron la muestra.
Para asegurarnos de que solo detectemos el ARN del coronavirus, y no el ADN o ARN de ningún otro organismo, necesitamos encontrar un poco de la secuencia de ARN del coronavirus que es exclusiva del coronavirus y no es compartida por ningún otro ser vivo.
El ARN del nuevo coronavirus fue secuenciado por científicos al principio del brote. Hay casi 30.000 bases (letras) en el genoma del coronavirus, que contienen las instrucciones para producir 29 proteínas diferentes.
Necesitamos hacer dos pedazos cortos de ADN («cebadores») que solo se adhieran a algún lugar de esa secuencia del genoma.
Los científicos eligieron dos fragmentos cortos de la secuencia en el gen E, de 22 y 26 bases de largo, para la prueba de PCR. La proteína E (envoltura) codificada por este gen ayuda a formar la membrana aceitosa del virus.
Los científicos crearon cebadores de ADN que solo se adhieren a esas partes del gen E y en ningún otro lugar.
(Por cierto, el ADN y el ARN se mantienen unidos, si tienen las secuencias correctas).
Aquí está la secuencia de ARN del gen E (el ARN está formado por bases G, C, A y U):
AUGUACUCAUUCGUUUCGGAAGAGACAGGUACGUUAAUAGUUAAUAGCGUACUUCUUUUUCUUGCUUUCGUGGUAUUCUU
GCUAGUUACACUAGCCAUCCUUACUGCGCUUCGAUUGUGUGCGUACUGCUGCAAUAUUGUUAACGUGAGUCUUGUAAAAC
CUUCUUUUUACGUUUACUCUCGUGUUAAAAAUCUGAAUUCUUCUAGAGUUCCUGAUCUUCUGGUCUAAACGAACUAAAUA
UUAUAUUAGUUUUUCUGUUUGGAACUUUAAUUUUAGCC
Y aquí están las secuencias de los dos cebadores de ADN utilizados en la prueba (el ADN está formado por bases G, C, A y T):
Cebador directo: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
Imprimación inversa: ATATTGCAGCAGTACGCACACA
Los cebadores solo se adherirán al gen E en las partes subrayadas aquí:
AUGUACUCAUUCGUUUCGGAAGAGACAGGUACGUUAAUAGUUAAUAGCGUACUUCUUUUUCUUGCUUUCGUGGUAUUCUU
GCUAGUUACACUAGCCAUCCUUACUGCGCUUCGAUUGUGUGCGUACUGCUGCAAUAUUGUUAACGUGAGUCUUGUAAAAC
CUUCUUUUUACGUUUACUCUCGUGUUAAAAAUCUGAAUUCUUCUAGAGUUCCUGAUCUUCUGGUCUAAACGAACUAAAUA
UUAUAUUAGUUUUUCUGUUUGGAACUUUAAUUUUAGCC
Así es como la prueba solo detectará el ARN del coronavirus, y no el ARN de ninguna otra cosa.
5) Si el virus está ahí, ¡Revisamos elADN!
Es hora de un poco de RT-PCR
Para detectar cualquier ARN de coronavirus presente, necesitamos hacer muchas copias de él, pero no podemos hacer fácilmente muchas copias de ARN directamente.
Por lo tanto, primero tenemos que hacer una copia de ADN del ARN. Esto se llama transcripción inversa (RT), que hacemos usando una enzima llamada transcriptasa inversa.
Una vez que tenemos la copia de ADN, podemos hacer muchas copias usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y una enzima llamada ADN polimerasa.
Usamos los cebadores del gen E en ambos pasos para que solo se copie el ARN del virus y nada más.
¿Cómo averiguamos si el ARN del virus se ha copiado correctamente?
Los laboratorios de pruebas realizan 45 «ciclos» de PCR en una muestra de prueba Covid-19, lo que demora un poco más de media hora. Después de este tiempo, una sola molécula de ARN del SARS-CoV-2 se habrá convertido en 17 millones de millones de moléculas de ADN idénticas. Son tan pequeños que TODAVÍA no puedes verlos con tus ojos.
Para ver cuánto ADN hay y saber si la prueba es positiva, la mezcla de reacción de PCR incluye una etiqueta especial que brilla cuando se corta.
La etiqueta se adhiere al mismo fragmento de ADN que uno de los cebadores.
Cuando se copia el ADN, la etiqueta se desprende del ADN y se corta. La etiqueta despegada y cortada comienza a emitir fluorescencia (brillar).
Estas etiquetas se pueden «ver» y medir con una máquina que detecta la luz. Cuanta más fluorescencia se detecte en una reacción de PCR, más copias de ADN se harán.
Entonces, cuando hay mucho brillo, sabe que el ARN del coronavirus estaba en la muestra del hisopo y se hicieron muchas copias de ADN y, por lo tanto, la prueba es positiva.
Si no hay brillo, no hubo ningún coronavirus en la muestra del hisopo, no se pudieron hacer copias de ADN y la prueba es negativa.
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